為什么新guan病毒不能只檢測一個靶點

目前，市面上常見的新guan病毒檢測靶點為ORF1ab和N基因或E基因。

但據WHO的相關文件，隨著疫情的進行，新guan病毒的靶點序列可能會產生突變，從而導致引物/探針無法與目的序列結合，導致假陰性。因此WHO建議檢測多個靶點。

以往上建議篩查時先檢測E基因（包膜基因），在確證時檢測RdRp基因（即RNA依賴性RNA聚合酶基因），該基因有助于辨別新guan與其他冠狀病毒^{【1】【2】}。

參考文獻：

1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. 

  2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

下面筆者即來介紹這款新guan病毒引物/探針。

一、用途：

新guan病毒RT-qPCR引物/探針（套裝）（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測和分析新guan病毒RNA。它僅用于研究，不用于臨床診斷。

二、描述：

  1. 該產品包括三個小管：

     ①橙蓋： 2019-nCoV Mix（凍干粉），1管。此管即新guan病毒引物/探針，可特異性擴增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依賴性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會被檢測到。（該引物/探針依據WHO診斷參考實驗室公布的新guan病毒引物/探針序列而設計）。

     ②綠蓋：Positive Control RNA（陽性對照RNA，凍干粉），1管。

    此陽性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。

     ③白蓋：PCR Grade Water（液體），1管。

  2.使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級水（③白蓋）復溶，并分裝，避免反復凍融。

  3.該引物/探針應與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,貨號192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反應檢測。

  4．檢測樣本需為抽提過的RNA樣本。

  5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測，擴增的人RNA酶P基因（過程對照）用ROX™通道檢測，用以評估樣本的制備質量。

三、產品特點：

  1. 靶點特別。依據WHO標準，此引物探針為新guan病毒RdRp基因，而非市面上常見的ORF1ab和N基因或E基因。

  2.陽性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。

  3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲存運輸方便，性能穩定。

  4. 適用于科研中，各種來源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動物細胞和細菌等。

四：使用：

RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl反應體積）

（1）1個反應需要加入：

酶預混液 （RT-qPCR mix）10μl ，

橙蓋（復溶的2019-nCoVMix引物/探針）5μl

（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。

設置qPCR程序

1個循環：55 ℃，10分鐘

1個循環：94 ℃，3 分鐘

45個循環：94 ℃，15秒

               58℃，30秒

終用FAM和ROX檢測。

更多參考文獻，請見：

1. Corman, V.M., et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill, 2020. 25(3).

2. LeBlanc, J.J., et al., Real-time PCR-based SARS-CoV-2 detection in Canadian Laboratories. J Clin Virol, 2020: p. 104433.

3. Uhteg, K., et al., Comparing the analytical performance of three SARS-CoV-2 molecular diagnostic assays. J Clin Virol, 2020. 127: p. 104384.

4. van Kasteren, P.B., et al., Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for. J Clin Virol, 2020. 128: p. 104412.

5. Lowe, C.F., et al., Detection of low levels of SARS-CoV-2 RNA from nasopharyngeal swabs using three commercial molecular assays. J Clin Virol, 2020. 128: p. 104387.

6. Igloi, Z., et al., Comparison of commercial realtime reverse transcription PCR assays for the detection of SARS-CoV-2. J Clin Virol, 2020. 129: p. 104510.