細胞培養(yǎng)支原體污染防控全攻略——從預(yù)防到處理的系統(tǒng)化指南  

一、支原體污染的危害與識別  

隱性威脅：支原體無細胞壁，可穿透0.22μm濾膜，常規(guī)抗生素（如青霉素）無效，常導(dǎo)致細胞生長緩慢、形態(tài)異常（如“空泡化”）、實驗重復(fù)性差，甚至基因表達譜改變。  

快速檢測：  

熒光染色法：使用染色，支原體DNA在紫外光下呈“星點狀”熒光。  

PCR檢測：針對支原體16SrRNA基因設(shè)計引物（如通用引物），靈敏度達10CFU/mL，3-4小時出結(jié)果。  

培養(yǎng)法：將細胞上清接種于支原體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)14天，觀察“煎蛋狀”菌落或酸堿指示劑變色。  

二、預(yù)防措施：源頭阻斷污染  

操作規(guī)范：  

嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，穿戴無菌手套、口罩，避免說話時飛沫污染。  

定期清潔生物安全柜、培養(yǎng)箱，使用75%酒精擦拭臺面，紫外線照射30分鐘。  

避免交叉污染：不同細胞系使用獨立培養(yǎng)瓶、移液器，禁止共用培養(yǎng)基或血清。  

材料篩選：  

選用支原體檢測合格的胎牛血清，避免使用來源不明的血清。  

培養(yǎng)基、胰蛋白酶等試劑需經(jīng)0.1μm濾膜過濾，或添加支原體抑制劑。  

環(huán)境監(jiān)控：  

定期檢測實驗室空氣、操作臺表面、培養(yǎng)箱水盤中的支原體含量，建立污染檔案。  

三、污染處理：精準(zhǔn)清除策略  

早期污染處理：  

若檢測到支原體，立即丟棄污染細胞，消毒培養(yǎng)瓶、移液器、生物安全柜。  

對未污染細胞進行“支原體清除培養(yǎng)”：添加支原體特異性抗生素，連續(xù)培養(yǎng)3-4代后再次檢測。  

頑固污染處理：  

使用“抗生素沖擊療法”：交替使用不同作用機制的抗生素（如四環(huán)素類+大環(huán)內(nèi)酯類），避免耐藥性產(chǎn)生。  

結(jié)合物理方法：如高溫處理（56℃30分鐘）、紫外線照射、過濾除菌等。  

替代方案：  

若細胞珍貴且無法清除支原體，可考慮使用“支原體清除試劑盒”，或通過有限稀釋法篩選未污染細胞亞群。  

四、后續(xù)監(jiān)控與質(zhì)量保證  

定期檢測：即使處理成功，也需每月對細胞進行支原體檢測，持續(xù)3-6個月，確保無復(fù)發(fā)。  

記錄與追溯：建立細胞培養(yǎng)檔案，記錄操作人員、試劑批號、檢測結(jié)果等信息，便于問題追溯。  

質(zhì)量認(rèn)證：對于科研或生產(chǎn)用細胞，建議通過第三方機構(gòu)進行支原體檢測認(rèn)證，確保符合國際標(biāo)準(zhǔn)。  

五、特殊注意事項  

避免過度依賴抗生素：長期使用抗生素可能導(dǎo)致細胞產(chǎn)生耐藥性，或掩蓋支原體污染癥狀。  

關(guān)注細胞狀態(tài)：支原體污染常伴隨細胞生長緩慢、形態(tài)異常，需結(jié)合顯微鏡觀察與檢測結(jié)果綜合判斷。  

人員培訓(xùn)：定期對實驗室人員進行支原體污染防控培訓(xùn)，提高操作規(guī)范性與污染識別能力。